荧光原位杂交（FISH）技术作为基因定位与定性研究的核心手段，凭借精准高效的优势，在生命科学研究领域占据重要地位。但复杂的实验流程常常让不少研究者，尤其是刚接触该技术的新手倍感棘手。而荧光标记核酸探针的出现，为简化实验流程、提升研究效率提供了绝佳解决方案 —— 它省去了生物素或地高辛系统中繁琐的免疫酶促反应，更具备独特的多重检测能力，借助荧光显微镜即可直接观察多个靶点，真正实现 “一次实验，多重结果”，成为高效开展多重 FISH 分析的优选工具。
本文将从荧光标记核酸探针的合成方法与 FISH 实验的关键操作环节入手，全方位拆解实验要点，助力研究者轻松攻克技术难点，大幅提升实验成功率。
一、荧光标记核酸探针合成选择指南
探针制备是 FISH 实验成功的核心基础，根据核酸类型的不同，荧光标记核酸探针主要分为DNA探针与RNA探针两类，其合成方法与特性各有侧重。
（一）荧光标记 DNA 探针
荧光标记 DNA 探针的合成常用方法包括缺口平移法、随机引物法及PCR法，核心原理均是将Cy3-dUTP、Fluorescein-dUTP等荧光标记脱氧核苷酸嵌入新合成的DNA链中。尽管这些合成方法应用广泛，但市面上相关试剂盒却较为稀缺。究其原因，这类方法合成的探针存在产量偏低、杂交效率不足及检测灵敏度有限等问题。同时，荧光标记脱氧核苷酸不仅种类较少，且成本高昂，进一步限制了其应用场景。
若实验对探针标记类型无强制要求，更推荐选择性价比更高的地高辛标记核苷酸制备 DNA 探针。通过结合酶促反应，地高辛标记探针的检测灵敏度通常优于荧光标记DNA探针。目前市面上罗氏、星启百代等品牌的地高辛标记试剂盒，技术成熟、口碑可靠，是科研中的优质选择。而若实验明确需要使用荧光标记探针，则建议优先考虑荧光标记 RNA 探针，其在杂交效率与检测灵敏度上均优于DNA探针。
（二）荧光标记 RNA 探针
荧光标记 RNA 探针是FISH实验中应用最广泛的探针类型，其合成主要通过体外转录实现，核心是将Cy3-UTP、Cy5-UTP、Fluorescein-UTP等荧光标记核糖核苷酸掺入RNA转录本中。
当前市面上赛默飞、罗氏、星启百代等品牌的相关试剂盒性能稳定，可满足不同实验需求。不过进口试剂价格相对较高，研究者可根据实验经费与具体需求灵活选择。若注重探针产量，推荐选用搭载基因工程改造 T7 RNA 聚合酶的试剂盒——该类酶的催化效率更优，单次反应产量比普通T7 RNA聚合酶高出50%以上。例如星启百代的探针合成试剂盒，单次制备可获得 5-9 ug RNA 探针，显著优于其他品牌2-6 ug的单次制备量。此外，该试剂盒还优化了反应体系，能促进更多荧光标记核苷酸掺入，为后续实验的高检测灵敏度提供有力保障。
二、荧光原位杂交（FISH）实验关键操作指南
除了优质探针的制备，实验过程中的每一个操作环节都直接影响最终结果。以下将详细拆解样本制备与固定、通透、杂交、洗涤及对照设置五大核心步骤，助力研究者精准把控实验细节。
（一）样本制备与固定
样本质量是 FISH 实验成功的前提，直接决定了后续实验的上限。实验中应优先选用新鲜的细胞或组织样本，避免样本变质影响核酸完整性。对于RNA FISH实验，操作需格外迅速，且全程使用RNase-free（无RNA酶）的试剂与耗材，严防RNA降解。
固定环节同样关键，需选择合适的固定剂（如多聚甲醛）并优化固定时间。固定不足会导致核酸降解、细胞形态破坏；固定过度则会降低样本通透效率，掩盖靶核酸位点。因此，固定的核心原则是在保持细胞形态完整的基础上，最大限度地暴露靶核酸，为探针结合创造条件。
（二）通透
通透步骤是连接样本固定与杂交的关键桥梁，其核心目的是在细胞膜上形成通道，让探针能够顺利进入细胞核，与靶 DNA 或RNA结合。通透不足会导致探针无法穿透细胞膜与细胞核，靶序列被蛋白质包裹，无法实现有效杂交；而通透过度则会破坏细胞形态与靶位点结构，导致实验失败。
通透液的成分是影响通透效果的核心因素，尽管研究者可通过查阅文献自行配置，但实验成功率与可重复性往往难以保证。因此，更建议使用专业的荧光原位杂交试剂盒。不同品牌试剂盒的通透液配方与技术存在差异，例如Starvio的通透工作液中特别添加了专属通透因子，既能高效在细胞膜上打孔，助力探针快速进入，又能有效避免对胞浆、胞核造成损伤，大幅提升原位杂交实验的成功率。
（三）杂交
杂交是 FISH 实验的核心步骤，而杂交液则是决定杂交结果的关键成分——它为探针与靶序列的特异性结合提供了适宜的反应环境。罗氏、Starvio等品牌的杂交液性能优异，不仅能促进探针与靶序列的特异性杂交，还能有效封闭组织细胞中探针的非特异结合位点，减少背景干扰。此外，这类杂交液中添加的稳定剂成分，可将探针分子 “局限”在局部区域，有效提高探针相对浓度，不仅能加速杂交反应速率，还能增强杂交体的稳定性，显著提升实验成功率。
（四）洗涤
洗涤步骤是保障实验特异性、降低背景噪音的最后一道关键关卡，核心在于精准把控洗涤液的盐浓度与洗涤温度。洗涤液中的盐浓度（通常以 SSC 浓度表示）直接影响杂交体的稳定性，实验中常用高盐浓度到低盐浓度的梯度洗涤策略，逐步洗脱非特异性结合的探针。温度方面，适当提高洗涤温度能有效去除非特异性结合或部分错配的探针，降低背景信号，但温度过高则可能洗掉特异性结合的探针，导致信号减弱甚至消失。因此，需根据探针特性与样本类型优化洗涤温度，平衡特异性与信号强度。
（五）设置对照
对照设置是 FISH 实验中不可或缺的环节，更是客观解读结果、排除实验假象的关键。实验中需同时设置阳性对照与阴性对照：阳性对照用于验证整个实验流程的操作准确性，确保试剂有效、步骤无误；阴性对照则用于确认观察到的信号是探针与靶序列的特异性结合，而非背景噪音或非特异性结合导致。
只有当阳性对照出现强信号、阴性对照无信号时，目标样本的 FISH 结果才具备可靠性与解读价值。若忽略对照设置，任何“阳性”或“阴性”结果都可能存在误导性，无法作为可靠的实验数据。
综上，荧光标记核酸探针的合理选择与规范合成，结合实验各环节的精准操作，是 FISH 实验成功的核心保障。希望本文的详细解析能为广大研究者提供实用参考，助力大家在基因定位与定性研究中高效推进实验，获得可靠结果。
